I) Les méthodes d’observation
1) Méthodes et techniques d’observations des cellules
L’observation des cellules est délicate du fait de leurs très petites tailles, et nécessite un certain nombre d’appareillages dont les microscopes. On distingue deux grands types de microscopes suivant leur résolution : les microscopes optiques et les microscopes électroniques.
a) Microscopes optiques
Les microscopes optiques (à lumière ou photoniques) permettent l’observation de cellules vivantes ou mortes, grâce à des coupes très fines de préparations fixées. Les microscopes optiques utilisent de la lumière visible et la qualité de l’image dépend du pouvoir séparateur qui donne la résolution du microscope limitée par la longueur d’onde de la radiation lumineuse. On obtient donc un grossissement x1000.
Pour les microscopes optiques à fluorescence la lumière reçue par l’œil ne traverse pas l’objet ; ici on utilise des molécules fluorescentes appelées des fluorochromes, qui sont utilisés comme colorant. La lumière excite les fluorochromes qui réémettent dans des plus grandes longueurs d’ondes c’est-à-dire dans des énergies plus basses.
Dans ce type de microscope on utilise des filtres qui permettent la formation d’une lumière monochromatique qui éclairera l’échantillon (cf. cours de physique). Les microscopes optiques à fluorescence nécessitent des cellules fixées, des coupes minces et entraînent malheureusement des superpositions d’images.
Les microscopes optiques à fluorescence sont souvent équipés de microscopie confocale qui remédie à la superposition d’images, en étudiant la cellule plan par plan.
b) Microscopes électroniques
Les microscopes électroniques utilisent des faisceaux d’électrons qui sont chargés, possèdent une masse et se comportent comme une onde. Plus les électrons sont accélérés plus les longueurs d’onde diminuent et plus la résolution augmente. Ces électrons possèdent des compartiments possédant un vide parfait afin de maintenir rectiligne les faisceaux d’électrons, et des lentilles électromagnétiques qui forment un condensateur. On obtient ici un grossissement x 100 000. Les microscopes électroniques nécessitent la déshydratation de l’échantillon et donc la mort des cellules et du fait du faible pouvoir pénétrant des électrons les échantillons doivent être sous forme de coupes ultra fines et donc soumis à des inclusions.
La microscopie électronique à balayage consiste à balayer une préparation par un faisceau d’électrons, permettant la mise en évidence des reliefs de l’échantillon.
2) Techniques de préparation des échantillons
a) Etudes des structures
Afin d’étudier des structures on utilise un certain nombre de techniques : préparation des coupes fines, coloration négative, ombrage métallique, cryodécapage.
La préparation des coupes fines se fait en plusieurs étapes :
- La fixation se fait par le formaldéhyde et le glutaraldéhyde, qui sont des aldéhydes très réactifs. Malheureusement la fixation tue les cellules mais permet leur immobilisation et leur conservation.
- La déshydratation permet l’élimination de l’eau en la remplaçant par des solvants de types xylène et toluène.
- L’inclusion dans de la résine, cire ou paraffine, permet une solidification de l’échantillon, par leur polymérisation.
- La formation des coupes ultrafines est réalisée par des microtomes.
- La coloration des coupes se fait par différents types de colorants ou méthodes de mise en évidence :
- Les colorants métachromatiques qui changent de couleur suivant la nature des structures colorées. On donnera comme exemple le May-Grunwald-Giemsa (MGG), qui correspond à l’association d’éosine et de bleu de méthylène, permettant la coloration des frottis sanguins.
- Les colorants histochimiques comme l’acide périodique de Schiff qui colore les polysaccharides et le noir soudan qui colore les lipides.
- La méthode histo-enzymatique qui permet la formation d’un produit coloré par action d’une enzyme sur son substrat incolore.
- Le montage rend la préparation observable.
La coloration négative permet de mettre en évidence le contour de petits objets, grâce à des projections de métaux lourds sur la préparation.
Les ombrages métalliques permettent d’accentuer les reliefs d’un objet en vaporisant sous vide une très fine couche métallique avec un certain angle d’incidence entraînant la formation d’ombre portée.
b) Mise en culture
La culture cellulaire est obtenue après le maintien en vie de cellules plus de 24 heures dans un milieu de culture artificielle. On met en évidence deux types de cultures :
- Les cultures organotypiques sont soumises à un maintien de la différentiation morphologique et fonctionnelle. Ces fragments d’organes ou tissus sont appelés des explants.
- Les cultures histiotypiques correspondent à une multiplication active mais sans maintien de l’organisation.
II) Les méthodes de fractionnement subcellulaire
Les méthodes de fractionnement subcellulaire consistent à séparer les différents composants cellulaires par destruction de la membrane plasmique, puis par désorganisation de la cellule.
1) Homogénéisation
Le but de l’homogénéisation est de rompre la membrane plasmique (ou la paroi pour les cellules végétales et fongique). Pour se faire on met les cellules en suspension dans un tampon de pH et de force ionique connus.
L’homogénéiseur est un tube de verre dans lequel on place la préparation puis un piston en verre. La cellule passera entre le tube de verre et le piston, sera ainsi comprimée et éclatera, libérant son contenu dans le tampon.
On obtient un homogénat avec tous les constituants de la cellule. La plupart des organites restent intactes, mais sans précaution particulière l’appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique vont être fragmentés sous forme de vésicules appelées microsomes.
2) Purification
a) Centrifugation différentielle
La centrifugation différentielle permet la purification de l’homogénat en fonction de la taille et de la densité de ses constituants. Pour se faire on centrifuge l’homogénat à différentes vitesses ; à chaque vitesse, différents organites se déposent dans le culot, qui sera prélevé :
- A 600g, on observe la sédimentation du noyau et du cytosquelette.
- A 15 000g, on observe la sédimentation des mitochondries, des lysosomes et des peroxysomes.
- A 100 000g (ultracentrifugation), on observe la sédimentation de la membrane plasmique, des microsomes et des grands polysomes.
- A 200 000g, on observe la sédimentation des ribosomes et des petits polysomes. Ce qui reste à la fin c’est la fraction hydrosoluble du cytosol.
b) Centrifugation par gradient préformé
La centrifugation par gradient préformé consiste à déposer une mince couche d’homogénat au dessus de la solution de saccharose dont la concentration varie de façon régulière et décroissante du bas vers le haut. Les différents constituants de l’homogénat sédimentent tous à des vitesses différentes, on obtient ainsi différentes bandes (la couche la plus dense étant au fond) que l’on séparera.
La vitesse de sédimentation dépend de la taille des molécules, de la forme des particules et de la densité. La vitesse de sédimentation est définie par le coefficient de sédimentation en unité Svedberg (S).
